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重組DNA的構(gòu)建(載體構(gòu)建)

日期:2021-07-29瀏覽:7630次

基本原理:
    外源目的DNA與載體分子的連接稱為DNA重組,重組的DNA稱為重組體或重組子。研究中需要克隆或表達的基因為外源DNA,載體是指能夠攜帶外源基因進入受體細胞,并在其中進行擴增或誘導外源基因表達的工具,其中質(zhì)粒載體最為常用。
    質(zhì)粒是獨立于細菌染色體外具有自我復制的DNA分子。所有的質(zhì)粒都有復制子、選擇性標志和多克隆位點3個共同的特性。質(zhì)粒載體的選擇包括載體的大小、載體拷貝數(shù)、多接頭以及篩選插入片段的能力,pcDNA3.1(+/-)是比較常用的真核表達載體。

基本步驟:
    1、目的DNA片段的獲得。這一步驟中,可以選擇通過設計引物進行PCR擴增來獲得目的DNA片段,也可以通過化學合成的方法來獲得目的DNA片段,這里值得注意的點,目的DNA片段5'和3'端需要引物合適的酶切位點,方便后續(xù)與質(zhì)粒載體的連接。
    2、目的DNA片段與質(zhì)粒連接。通過選擇的酶切位點將環(huán)形的質(zhì)粒酶切成線性,與目的DNA片段進行連接反應,而后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞中,進行培養(yǎng)。
    3、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化及鑒定。挑選2-3個單克隆置于含有抗性的液體
培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)。提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定,雙酶切后電泳,能夠看到存在與目的DNA片段大小一致的條帶,說明此單克隆插入了目的DNA片段,而至于目的DNA片段中堿基序列是否存在突變點,需進行一代測序驗證。只有同時滿足雙酶切鑒定大小合適并且測序后DNA堿基序列*一致的單克隆菌才被認定為構(gòu)建成功的重組子。
    4、鑒定正確的重組質(zhì)粒擴大培養(yǎng)及保種。將上述構(gòu)建成功的重組子質(zhì)粒菌種再一次擴大培養(yǎng),提取重組子質(zhì)粒以及進行保種,方便后續(xù)實驗使用。
    值此,包含此外源DNA的重組DNA的構(gòu)建算全部完成。

注意事項及心得體會:
    1、目的DNA片段獲取過程中,如果選擇通過設計引物進行PCR擴增方法來獲得,建議選擇高保真的酶來進行擴增反應,這樣在一定程度上可以降低因為擴增反應而產(chǎn)生的堿基引入錯誤。
    2、PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物盡量不要放置時間過長,最好是即時進行連接。
    3、連接體系中載體與目的基因的分子數(shù)比例,需要摸索合適的比例,一般為1:3--1:10,合適的比例能夠提高連接效率。
  

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